Daun pepaya ( Carica papaya L.) merupakan salah satu tanaman yang berpotensi sebagai antibakteri yang berfungsi untuk mencegah perkembangan bakteri-bakteri tertentu yang hidup di usus kita (Andareto 2015). Kandungan senyawa aktif yang terdapat dalam daun pepaya yang berpotensi sebagai antibakteri adalah flavonoid, alkaloid dan saponin (Anonim 2000). Bakteri endofit adalah bakteri yang hidup di dalam jaringan tanaman inang tanpa menyebabkan gejala-gejala penyakit (Bhore dan Sathisha 2010). Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri endofit dan menguji aktivitas antibakteri dari isolat bakteri endofit yang terdapat pada daun pepaya (Carica papaya L.) terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Metode isolasi yang digunakan adalah metode tanam langsung pada medium Nutrien Agar. Produksi metabolit sekunder bakteri endofit dilakukan dengan cara fermentasi menggunakan medium nutrient broth dan diuji aktivitasnya dengan metode difusi agar. Hasil isolasi diperoleh 5 isolat bakteri endofit daun pepaya (Carica papaya L.) dan isolat DPR 3 merupakan isolat yang berpotensi menghasilkan senyawa aktif antibakteriterhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli masing-masing adalah 1,008 x 10-4 kali kloramfenikol dan 1,13 x 10-5 kali kloramfenikol.